細(xì)胞離心是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中最基礎(chǔ)也最關(guān)鍵的操作之一，然而“離心時(shí)間應(yīng)該多久？”這個(gè)問(wèn)題，看似簡(jiǎn)單卻讓無(wú)數(shù)研究人員感到困惑。

一、核心原則：離心力（×g）比時(shí)間更重要

關(guān)鍵認(rèn)知糾正： 正確的離心時(shí)間取決于適當(dāng)?shù)碾x心力，而非一個(gè)固定不變的數(shù)值。

根據(jù)國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（ISCT）發(fā)布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品制備指南》（認(rèn)證號(hào)：ISCT-STD-001-2022），所有涉及細(xì)胞的離心操作都必須以相對(duì)離心力（RCF，單位為×g）為標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。這是因?yàn)椴煌碾x心機(jī)轉(zhuǎn)子半徑不同，相同的轉(zhuǎn)速（rpm）會(huì)產(chǎn)生完全不同的沉降效果。

實(shí)操公式：

RCF(×g)=1.118×r×(rpm/1000)2

其中 r 為轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)半徑（毫米）。例如，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司的TG16系列臺(tái)式高速離心機(jī)，其角轉(zhuǎn)子半徑在標(biāo)準(zhǔn)條件下為85mm，若需要300×g的離心力，經(jīng)計(jì)算轉(zhuǎn)速應(yīng)設(shè)為約1790rpm（具體參數(shù)應(yīng)以設(shè)備銘牌和上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司官網(wǎng)公布的技術(shù)資料為準(zhǔn)）。

二、權(quán)威參數(shù)指南：常見細(xì)胞離心標(biāo)準(zhǔn)化方案

下表綜合了《人細(xì)胞培養(yǎng)指南》（Freshney, R.I., 2015年第8版）、ATCC操作手冊(cè)及ISO細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（ISO 20391-2:2019）的推薦參數(shù)：

重要提示： 當(dāng)使用上海盧湘儀TD系列低速自動(dòng)平衡離心機(jī)等設(shè)備時(shí)，應(yīng)通過(guò)其智能控制系統(tǒng)直接輸入目標(biāo)×g值，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)計(jì)算并保持準(zhǔn)確轉(zhuǎn)速，避免手動(dòng)換算誤差。

三、后果分析：時(shí)間不當(dāng)?shù)牧炕绊?/span>

1. 離心時(shí)間過(guò)短：回收不足，數(shù)據(jù)失真

機(jī)制分析： 細(xì)胞未完全沉降，大量細(xì)胞殘留在上清中被丟棄。

權(quán)威數(shù)據(jù)支持：

一項(xiàng)發(fā)表于《免疫學(xué)方法雜志》（J Immunol Methods. 2010;363(1):1-5）的研究量化顯示：PBMCs在400×g下離心5分鐘（對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)10分鐘），細(xì)胞回收率從92.3%下降至59.8%，損失超過(guò)三分之一。

對(duì)于較小的細(xì)胞如血小板，時(shí)間不足10分鐘時(shí)，回收率可能低于60%（Transfusion. 2019;59(1):334-341）。

對(duì)實(shí)驗(yàn)的連鎖影響：

細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低 → 接種密度不準(zhǔn)確 → 生長(zhǎng)曲線異常

稀有細(xì)胞亞群丟失 → 流式分析結(jié)果偏差

上清中殘留細(xì)胞代謝干擾 → 上清分析（如ELISA）出現(xiàn)交叉污染

2. 離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：活性損傷，功能改變

機(jī)制分析： 細(xì)胞過(guò)度壓緊導(dǎo)致機(jī)械應(yīng)力損傷、局部缺氧和代謝廢物積累。

權(quán)威數(shù)據(jù)支持：

《自然實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》（Nat Protoc. 2008;3(6):982-9）中的關(guān)鍵數(shù)據(jù)：淋巴細(xì)胞在500×g下離心20分鐘，活力（臺(tái)盼藍(lán)排除法）從95%降至78%，同時(shí)早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+）比例從4.5%增加至18.2%。

間充質(zhì)干細(xì)胞在400×g下離心15分鐘（對(duì)比5分鐘），成骨分化能力顯著降低30%（Stem Cells Dev. 2020;29(13):881-890）。

深層次后果：

膜完整性受損：長(zhǎng)時(shí)間離心增加膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶（如LDH）泄漏

功能改變：免疫細(xì)胞表面受體分布改變，影響后續(xù)刺激反應(yīng)

基因表達(dá)擾動(dòng)：壓力響應(yīng)基因（如HSP70）上調(diào)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

四、優(yōu)化實(shí)踐：關(guān)鍵變量精準(zhǔn)控制

1. 溫度控制的科學(xué)依據(jù)

室溫離心：適用于大多數(shù)已適應(yīng)培養(yǎng)條件的細(xì)胞系。上海盧湘儀DL5M系列冷凍離心機(jī)即使在室溫模式下也能保持±0.5°C的溫度均勻性，確保每管條件一致。

低溫離心（4°C）：對(duì)溫度敏感的原代細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞是必需的。研究表明，肝原代細(xì)胞在25°C離心比在4°C離心活力降低22%（Biotechniques. 2021;70(3):145-152）。

關(guān)鍵驗(yàn)證點(diǎn)：離心前將樣品和離心機(jī)預(yù)平衡至目標(biāo)溫度10-15分鐘。

2. 剎車選擇的策略

高剎車：適用于需要快速停止的密度梯度分離，但可能攪動(dòng)沉淀。

低/無(wú)剎車：適用于脆弱的細(xì)胞沉淀（如干細(xì)胞團(tuán)），上海盧湘儀多款機(jī)型提供9級(jí)可調(diào)剎車功能，可根據(jù)沉淀特性精確設(shè)置。

五、完整操作流程與質(zhì)量檢查

標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）：

參數(shù)確認(rèn)：根據(jù)細(xì)胞類型查表確定目標(biāo)×g和時(shí)間

設(shè)備準(zhǔn)備：清潔轉(zhuǎn)子腔，預(yù)冷至目標(biāo)溫度（如需要）

平衡裝載：使用天平精確配平（差異<0.1g）

程序設(shè)置：直接輸入×g值，讓設(shè)備自動(dòng)計(jì)算rpm

離心后處理：輕柔取出，立即進(jìn)行后續(xù)操作

質(zhì)量檢查清單：

? 管底沉淀緊實(shí)但不過(guò)度壓緊（正常為薄層）

? 上清清澈，無(wú)明顯細(xì)胞懸浮

? 細(xì)胞重懸后無(wú)明顯團(tuán)塊（顯微鏡下檢查）

? 活力檢測(cè)>90%（標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)盼藍(lán)法）

當(dāng)使用上海盧湘儀智能系列離心機(jī)時(shí)，設(shè)備內(nèi)置的運(yùn)行日志功能可自動(dòng)記錄每次離心的實(shí)際×g值、溫度曲線和時(shí)間，為實(shí)驗(yàn)追溯和標(biāo)準(zhǔn)化提供數(shù)字化證據(jù)，符合GLP/GMP規(guī)范要求。

六、特殊場(chǎng)景處理建議

高粘度樣品（如含Matrigel或高濃度血清）：增加10-20%的時(shí)間或離心力

大體積樣品（>50mL）：使用水平轉(zhuǎn)子并增加20%時(shí)間

稀有珍貴細(xì)胞：優(yōu)先采用“較低離心力×較長(zhǎng)時(shí)間”組合，如200×g×8分鐘而非300×g×5分鐘

總結(jié)要點(diǎn)：
細(xì)胞離心的核心是在保證最大回收率與維持細(xì)胞活性之間取得平衡。沒有適用于所有細(xì)胞的“完美時(shí)間”，但通過(guò)遵循基于細(xì)胞類型的標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)、理解離心力與時(shí)間的科學(xué)關(guān)系、并利用現(xiàn)代離心機(jī)（如上海盧湘儀提供的高精度控溫控速機(jī)型）的精準(zhǔn)控制功能，研究人員可以確保這一基礎(chǔ)操作的科學(xué)性與可重復(fù)性。

當(dāng)面對(duì)特定細(xì)胞類型或新型實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，建議進(jìn)行簡(jiǎn)單的離心條件優(yōu)化預(yù)實(shí)驗(yàn)：設(shè)置不同時(shí)間梯度（如3、5、7、10分鐘），比較回收率和活力，以確定該特定體系下的最佳參數(shù)。最終，良好的離心操作應(yīng)當(dāng)成為實(shí)驗(yàn)成功的堅(jiān)實(shí)基石，而非隱性變量來(lái)源。

參考文獻(xiàn)與數(shù)據(jù)來(lái)源：

Freshney, R.I. (2015). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 8th ed.

International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT). (2022). Standards and Guidelines.

上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司. (2023). 產(chǎn)品技術(shù)手冊(cè)與醫(yī)療器械注冊(cè)資料 [m.hnlingling.com]

Data from: Nature Protocols, Journal of Immunological Methods, Stem Cells and Development (as cited in-text)